蛋白質(zhì)二級結構是多肽鏈通過氫鍵連接盤旋而形成的結構,包括α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規(guī)則卷曲4種結構,其中前兩者為規(guī)則有序結構,后兩者相較于前兩者表現(xiàn)得更加無序。當?shù)鞍踪|(zhì)受到外界條件影響時,蛋白質(zhì)二級結構會發(fā)生一定程度的改變,從而導致其功能特性發(fā)生變化,如凝膠性、持水能力、溶解性、乳化性和流變性等,因此研究蛋白質(zhì)二級結構的變化,有助于預測蛋白的功能特性,進而了解原料的加工特性。

目前國內(nèi)外研究蛋白質(zhì)二級結構的方法有傅里葉紅外光譜法、拉曼光譜法、X-射線衍射法、圓二色譜法以及核磁共振法,其中傅里葉紅外光譜法和拉曼光譜法是*常用的方法。

傅里葉紅外光譜法測定蛋白質(zhì)二級結構的方法及優(yōu)缺點

傅里葉紅外光譜法可檢測不同狀態(tài)的蛋白樣品,包括固體樣品和液體樣品,但因水在1640cm^-1附近的吸收會對測定產(chǎn)生強大干擾,因此通常情況下固體樣品更多被選擇。固體樣品制備方法有很多,*常用的是KBr壓片法。樣品薄片制備后,置于紅外光譜儀中進行測定,常用的測定參數(shù)為:掃描范圍400~4000cm^-1,以KBr空白片做參比,分辨率設置為4cm^-1,掃描次數(shù)為128次,得出圖譜。將圖譜在傅里葉紅外光譜儀中進行初步處理,用OPUS軟件進行基線校正、去卷積以及二階導數(shù)擬合(直至R²不變?yōu)橹?/span>),確定各個子峰與二級結構對應關系,根據(jù)各子峰面積百分比計算各部分二級結構含量,每組樣品平行測定多次,取平均值。

傅里葉紅外光譜法具有操作簡單、靈敏度高、分辨率好、掃描速度快、信噪比高、能檢測蛋白質(zhì)結構微小變化等特點。有如下優(yōu)勢:

(1)不受官能團、相對分子質(zhì)量等條件限制,測定樣品量少,對樣品沒有特殊要求,可以對水溶液、晶體和固體中的蛋白質(zhì)進行構象分析,可鑒定多種成分。

(2)傅里葉紅外光譜法應用范圍廣,不但能夠直接進行檢測分析,還可以跟其他色譜、質(zhì)譜儀聯(lián)用,極大提高了檢測準確性。

(3)不受其他物質(zhì)干擾,可從復雜的物質(zhì)體系中快速識別目標物質(zhì),且無需重復檢測,檢測重現(xiàn)性好。

但由于整個系統(tǒng)設備體積大、價格高、測量氣體樣品時易受其他氣體干擾,使用壓片法測量時制得的樣品易碎且必須嚴格干燥,增加了操作的復雜性。

拉曼光譜法測定蛋白質(zhì)結構的方法及優(yōu)缺點

采用拉曼光譜法檢測蛋白樣品時,與傅里葉紅外光譜法不同,蛋白提純后可直接置于拉曼光譜儀中進行測定,常用的測定參數(shù)設定為:掃描波長為785nm,激光功率為300mW,掃描范圍:400~4000cm^-1,掃描時間每次60s,4次掃描進行累加,以苯丙氨酸[(1003±1)cm^-1]作為歸一化因子,并用顯微鏡進行觀察,將光譜用Origin8.5進行平滑處理,采用OPUS軟件進行擬合分析并通過峰面積比得到各二級結構含量。

拉曼光譜法具有靈敏度高,樣品量少(μg級),分析速度快、操作簡單快速等特點,可進行無損分析,試樣可直接通過光纖探頭進行測量。有如下優(yōu)勢:

(1)此方法對樣品狀態(tài)不設限制,可檢測固、液、氣多種狀態(tài)樣品物質(zhì)。

(2)拉曼光譜法無需對樣品進行預處理,樣品可在其本征狀態(tài)下直接進行測試,避免了對樣品的破壞及檢測過程中人為導致的誤差。

(3)由于水的拉曼散射很弱,因此拉曼光譜法非常適合研究水體系,且在進**體檢測時,無需分離樣品氣體,可同時檢測多組分氣體樣品,大大節(jié)約了時間成本。

傅里葉紅外光譜法和拉曼光譜法已成為表征蛋白質(zhì)二級結構強有力的工具,通過對圖譜的處理分析,可獲取蛋白質(zhì)二級結構信息。但這2種方法各有優(yōu)缺點,傅里葉紅外光譜法更適合干燥易磨粉的樣品,拉曼光譜法則對樣品狀態(tài)沒有限制。